Bollettino di Microbiologia e Indagini di Laboratorio vol. 12, n. 1, 1992            
                             
                             
                             
        Valutazione di un metodo colorimetrico rapido (Peptidase A test) per la identificazione presuntiva di Streptococcus pyogenes ed Enterococchi  
                             
      A. Di Girolamo, G. Catamo, L. Cellini, N. Allocate, A. Faraone, S. Brocco**, R. Piccolomini*
                             
          Istituto di Medicina Sperimentale - * Cattedra di Microbiologia, Facolta di Medicina e Chirurgia University degli Studi di Chieti ** Liofilchem sx.l., Roseto degh Abritz=i (Teramo)    
                             
            Riassunto. Si riportano i risultati conseguiti con 1'uso di un test colorimetrico (Peptidase A Test) su tampone per 1'identificazione presuntiva e rapida di Streptococcus pyogenes e di Enterococchi.      
            Nei confronti dei 95 Streptococcus pyogenes saggiati, su un totale di 172 stipiti saggiati (Streptococchi Gruppo B, C, G non A, B, C, G, Staphylococcus spp., Neisseria spp., E. coli e Klebsiella pneumoniae) il test ha rivelato il 100% di sensibilitA (identificazione presuntiva) e il 100% di specificity rispetto al test ally Bacitracina. Nei confronti di 74 ceppi di Enterococco e- di altri 25 ceppi di Streptococcus spp. non-Enterococchi, il Peptidase A Test ha mostrato una piena specificity e sensibility nel discriminare gli Enterococchi da altri Streptococchi non-Enterococchi. tl test di tolleranza all'NaCl (6,5%) si e mostrato inattendibile per il 15% dei ceppi di Enterococco.      
                 
            Da quanto emerso, questo nuovo test su tampone rappresenta una valida altemativa ad altri sistemi giA in use nee laboratori di batteriologia clinica per l'identificazione rapida di Streptococchi f3-emolitici di Gruppo A e di Enterococchi.      
                 
                             
            Abstract. A rapid colorimetric swab-test (Peptidase A test), based upon pyroglutamyl aminopeptidase activity, is described.      
            This test could replace bacitracin susceptibility for presumptive identification of Group A streptococci as well as 6.5% NaCl agar tolerance for presumptive identification of Group D streptococci (enterococci).      
            Of 95 Streptococcus pyogenes isolates from primary plates, 87 gave positive reactions, and the remaining 8 were positive on retesting in pure culture.      
            Of 74 enterococcal isolates tested, all gave positive reactions.        
            Despite occasional positive reactions with only two non-streptococcal strains studied (Staphylococcus epidermidis and Klebsiella pneumoniae) the Peptidasi A Test could be useful and cost effective in clinical bacteriology laboratories.      
                             
      Introduzione       Sebbene quasi tutti gli Streptococchi di Gruppo A siano sensibili alla Bacitracina (identificazione presuntiva positiva), si è notato the un certo numero, variante tra il 5 ed il 20%, di Streptococchi B-emolitici non appartenenti al Gruppo A può risultare sensibile al test della Bacitracina con il conseguente erroneo inserimento di questi germi al gruppo dei Bemolitici di Gruppo A (4,9).
                   
      Il test di sensibilità alla Bacitracina è stato usato per molti anni per distinguere presuntivamente gli Streptococchi emolitici di Gruppo A da quelli non di Gruppo A (7).    
      Un potenziale punto debole nella interpretazione dei risultati ottenuti con il test di sensibilità alla Bacitracina è stato e rimane la sua bassa specificità.    
          Gli Enterococchi (Streptococchi a-3-y-emolitici di
  12             A. Di Girolamo et al.
                   
Gruppo D) sono molto piu resistenti agli agenti antimicrobici rispetto ad altri Streptococchi non-Enterococchi; ragione per cui è importante che i ceppi di Enterococco vengano rapidamente ed accuratamente identificati (8,11,12).            
  I tamponi sono impregnati con il substrato L-pyrrolidonyl-p-naphthylamide (PYR) che, in presenza dell'enzima L-pyroglutamyl-aminopeptidasi, presente nel germe in esame, reagisce con formazione di un colore rosy-rosso a seguito di aggiunta di un'aliquota del reagente N,N-dimethyl-amino-cinnamaldeide.
Il metodo convenzionale di identificazione presuntiva degli Enterococchi che impiega 1'Agar Bile Esculina + 6,5% NaCI è un test accurato ma richiede, in diversi casi, anche 48 ore di incubazione.  
           
Nel 1981 Schierl e Blasevic hanno proposto un test rapido per 1'identificazione presuntiva di Enterococchi, ma solo 1'83% di tale germi fu identificato dopo sole 4 ore (10).              
    Materiali e metodi        
             
    A) Identifica=ione degli Streptococchi R-emolitici di Gruppo A Sono stati saggiati 172 Streptococchi emolitici provenienti da isolamento primario (36) e da sottoisolamento (98) in Columbia CNA Agar + 5% Sheep Blood (Liofilchem) provenienti da pazienti ospedalizzati ed ambulatoriali sottoposti a prelievo di essudato faringo-tonsillare mediante tampone (Bio-Cult Stuart-. Liofilchem).
Più o meno nello stesso periodo, è stato proposto un test di co-agglutinazione per identificare rapidamente e specificamente gli Streptococchi di Gruppo D (Enterococchi); tuttavia è necessario sempre il test suppletivo di tolleranza all'NaCl (6) che, comunque, alle volte può non essere probante. Infatti, la mancanza di crescita di stipiti di Enterococco in Agar + 6,5% NaCl può portare ad una loro falsa identificazione con conseguente erronea valutazione nel trattamento di pazienti ai quali si attribuiscono infezioni causate da altri Streptococchi e non già dai veri agenti etiologici quali, appunto, gli Enterococchi.  
  Utilizzando il sistema automatico VITEK 30 jr. (Bio-Merieux Italia S.p.A.; Roma) per ('identificazione biochimica dei ceppi (GPI) unitamente al metodo classico di agglutinazione su latex (Streptex; Wellcome Italia S.p.A., Pomezia - Roma) sono stati tipizzati 95 Streptococcus pyogenes di Gruppo A, 14 Streptococchi P-emolitici di Gruppo B, 15 Streptococchi di Gruppo C. 9 Streptococchi di Gruppo G e 4 Streptococchi P-emolitici di Gruppo NON A,B,C,G.
  Sono stati inseriti nella prova di valutazione del Kit "Peptidase A Test", quale termine di confronto, anche i seguenti ceppi Gram-negative e Gram-positive di recente isolamento clinico: 10 Staphylococcus aureus, 7 Staphylococcus epidermidis, 3 Neisseria spp., 10 E. coli e 15 Klebsiella pneumoniae appartenenti alla collezione batterica della Cattedra di Microbiologia dell'Universita di Chieti.
Più recentemente, ed a seguito sia di osservazioni di Godsey, Schulman ed Eriquez (Abstr. Annu. Meet. Am. Soc. Microbiol. 1981, C84, p. 276), sia di studi effettuati da altri Autori (1,2,3), si è evidenziato che la L-pyrrolidonyl-p-naphthylamide (PYR) è un substrato che è idrolizzato dal 100% sia degli Streptococcus pyogenes che dal gruppo degli Enterococchi, attraverso 1'azione idrolitica dell'enzima L-pyroglutamyl-aminopeptidasi presente in tutti questi batteri. L'evidenziazione colorimetrica di tale attività (reazione positiva al PYR) permette, cosi, di identificare presuntivamente ed in modo rapido gli Streptococchi P-emolitici di Gruppo A e gli Streptococchi di Gruppo D (Enterococchi) da tutti gli altri germi appartenenti al genere Streptococcus.  
  Con tutti i ceppi di Streptococcus spp. saggiati, si e anche proceduto, per un confronto con il "Peptidase A Test", ad eseguire una prova per la valutazione della sensibility alla Bacitracina utilizzando dischetti di carta imbibiti con 10 pg/ml di antibiotico (Oxoid Italia S.p.A.. Milano).
  I risultati del test sono riportati in Tabella 1.  
           
  B) Identifica=ione degli Enterococchi      
  Sono stati utilizzati 74 ceppi di Streptococchi appartenenti al Gruppo D (Enterococchi) provenienti da ambiente clinico e da campioni di acque superficiali inquinate. Per confronto sono stati saggiati anche 20 ceppi di Streptococchi non P-emolitici e non di Gruppo D (non Enterococchi) isolati da campioni odontoiatrici e 5 ceppi di Streptococcus pneumoniae di provenienza pediatrica.
Sulla base di quanto sopra detto, presso la Cattedra di Microbiologia dell'Istituto di Medicina Sperimentale dell'Universita "G. D'Annunzio" di Chin si e' voluto saggiare un nuovo Kit diagnostico denominato "Peptidase A Test" (Liofilchem s.r.l. - Roseto degli Abruzzi - Teramo) test rapido su tampone per 1'identificazione presuntiva e rapida di Streptococchi p-emolitici di Gruppo A (Streptococcus pyogenes) e Streptococchi a-b-y- emolitici di Gruppo D (Enterococchi).  
  Tutti i ceppi sono stati identificati mediante metodi convenzionali (5) e con il supporto delle cards identificative (CPI) per il genere Streptococcus del sistema automatico VITEK 30 jr. Colture pure di ogni singolo ceppo sono state utilizzate per la valutazione del "Peptidase A Test". Solo per gli Enterococchi, e stato utilizzato, quale test di confronto, il terreno di coltura Columbia Blood Agar + 5% Sheep blood (Liofilchem srl) addizionato del 6,5% di NaCl per il test della tolleranza al cloruro di sodio.
Identificazione presuntiva di Streptococcus pyogenes ed Enterococchi con Peptidasi A Test             13
                                   
Tabella 1. Reazioni al metodo colorimetrico enzimatico (Peptidasi A - Test) di ceppi di Streptococcus spp., germi Gram-positivi non streptococcici e di stipiti batterici Gram-negativi.
Confronto col test di sensibilita alla Bacitracina.                          
                                   
  Microrganismo
  No. di ceppi

  saggiati (Tot. 172)
  No. di

PYR+
  ceppi

  PYR-
  No. di ceppi

sensibili
Bacitracina  

resistenti  
        
  Streptococcus pyogenes Gr. A
  95
87+8 (a)
  0
95
  0
       
  Streptococchi R-emolitici Gr. B
  14
0
  14
3
  11
       
  Streptococchi Gr. C
  15
0
  15
2
  13
       
  Streptococchi Gr. G
  9
0
  9
1
  8
       
  Streptococchi R-emolitici
                 
  non di Gr. A,B,C,D,G
  4
0
  4
1
  3
       
  Staphylococcus aureus
  10
0
  10
-
  -
       
  Staphylococcus epidermidis
  7
I (b)
  6
-
  -
       
  Neisseria spp.
  3
0
  3
-
  -
       
  E. coli
  10
0
  10
-
  -
       
  Klebsiella pneumoniae
  5
1 (b)
  4
-
  -
       
                                   
  (a) Ceppi che, all'isolamento primario risultarono PYR-negativi; dopo sottoisolamento diedero risultato positivo al PYR-test. (b) Ceppi the risultarono PYR-positivi.      
                                   
  Tabella 2. Reazioni al metodo colorimetrico enzimatico (Peptidasi A-Test) di ceppi di Enterococchi e di Streptococchi non - Enterococchi.  
                                   
  Confronto col test di tolleranza al 6,590 di NaCl in Columbia Agar Sangue.                  
                                   
  Microrganismo
  No. di ceppi

  saggiati (Tot. 99)
  No.

  PYR+
  di ceppi

  PYR
  No. di ceppi tolleranti

  al 6,590 di NaCl
     
  Streptococcus faecalis
  48
  48
  0
  42
     
  Streptococcus faecium
  12
  12
  0
  10
     
  Streptococcus durans
  14
  14
  0
  11
     
  Streptococcus mitis
  4
  0
  4
  0
     
  Streptococcus mutans
  7
  0
  7
  0
     
  Streptococcus salivarius
  6
  0
  6
  0
     
  Streptococcus sanguis
  3
  0
  3
  0
     
  Streptococcus pneumoniae
  5
  0
  5
  0
     
                                   
Risultati             Streptococco B-emolitico non di Gruppo A,B, C,D,G, e risultato positivo al "Peptidasi A-Test", mentre ben 7 ceppi su 42 (16,7%) sono risultati sensibili al test della Bacitracina.
               
I dati riportati in Tabella 1 dimostrano chiaramente che, nei confronti dei ceppi di Streptococcus spp. saggiati, il "Peptidasi A-Test" (PYR Test) si è rivelato altamente sensibile (100%) nell'identificazione presuntiva rapida degli Streptococchi B-emolitici di Gruppo A. Inoltre, se confrontato con il test alla Bacitracina, il "Peptidasi A-Test" ha mostrato un'elevata specificità; infatti, nessuno dei 42 ceppi sia di Streptococco appartenenti ai Gruppi B,C,G, sia di  
  Da notare, inoltre, che il risultato ottenuto inizialmente dagli 8 ceppi di Streptococcus pyogenes, discordante rispetto alle attese e, probabilmente, dovuto ad un insufficiente numero di germi usati per il Peptidasi A Test, come pure ad una possibile interferenza di germi contaminanti presenti nella coltura primaria. Infatti, un sottoisolamento dei germi ha re-
14                 A. Di Girolamo et al.
                   
          Da quanto precede ed in considerazione dei dati riportati da altri Autori che ben concordano con quelli ottenuti nella presente sperimemazione, si puo senz'altro affermare che il "Peptidasi A Test" è un metodo colorimetrico rapido ed efficace per la identificazione presuntiva di Streptococcus pyogenes e di Enterococchi sia in campo clinico che in campo igienico-sanitario.
so possibile 1'identificazione precisa a livello di Gruppo mediante il test al latice e, nel contempo, una positività netta al PYR Test.    
Da segnalare, infine, anche 1'occasionale inattesa forte positività al PYR Test da parte di due ceppi Gram-positivi e Gram-negativi saggiati (Staphylococcus epidermidis e Klebsiella peuumoniae).    
I risultati conseguiti nella prova utilizzando il "Peptidasi A Test" nei confronti di 74 ceppi di Enterococco e di altri 25 ceppi di Streptococcus spp. (non Enterococchi) sono riportati nella Tabella 2.    
             
    Ringraziamenti    
Sia i ceppi di Streptococcus faecalis, che quelli di Streptococcus faecium hanno evidenziato una netta positività al PYR Test contrariamente agli altri 25 ceppi di Streptococchi non Enterococchi che si sono dimostrati insensibili al "Peptidasi A Test". Di contro, il test di tolleranza all'NaCl si è dimostrato non specifico per 1'identificazione presuntiva di Enterococchi. Infatti, 11 ceppi (15%) di Enterococco appartenenti alle specie saggiate sono risultati intolleranti ad una concentrazione del 6,5% di NaC1 nel terreno di coltura.              
    Si desidera ringraziare la LIOFILCHEM s.r.l. - Roseto degli Abruzzi (TE) - per il supporto tecnico prestato.
             
    Bibliografia      
             
      1. Bosley GS, Facklam RR, Grossman D. Rapid identification of Enterococci. J. Clin. Microbiol. 18, 1275-1277, 1983. 2. Ellner PD, Williams DA, Hosmer MA, Cohenford MA. Preliminary evaluation of a rapid colorimetric method for the presumptive identification of group A streptococci and enterococci. J. Clin. Microbiol. 22, 880-881, 1985.
           
            3. Facklam RR, Thacker LG, Fox B, Eriquez L. Presumptive identification of Streptococci with a new test system. J. Clin. Microbiol. 15, 987-990, 1982.
Discussione e Conclusione        
            4. Facklam RR, Padula JF, Wortham EC, Coosey RC, Rountree HA. Presumptive identification of group A, B, and D streptococci on agar plate media. J. Clin. Microbiol. 9, 665672, 1979.
Sebbene sul mercato oggi siano disponibili vari tests per 1'identificazione di Streptococchi P-emolitici di Gruppo A, 1'elevato costo dei Kits, i tempi e le modality di esecuzione non certo brevi e semplici di alcuni, o la non elevata specificità di altri ne rendono 1'uso non propriamente agevole od univoco.      
      5. Lennette EH, Balows A., Hausler WJ Jr, Shadomy HJ eds. Manual of Clinical Microbiology (4rd ed.). American Society for Microbiology. Washington. D.C., 1985.
      6. Lim DV, Mamell H. Confirmatory identification of group D streptococci by slide coagglutination. Curr. Microbiol. 4, 151-154, 1980.
Il "Peptidasi A Test", quale sistema di identificazione presuntiva, può rappresentare in questo caso una valida alternativa in quanto caratterizzato da alcuni vantaggi rispetto, ad esempio, ai tests di agglutinazione al latice. Esso, infatti, è considerevolmente più veloce e semplice, meno soggettivo nella lettura dei risultati, non presenta reazioni crociate con altri Streptococchi emolitici, ha un costo sensibilmente inferiore e può essere conservato a temperatura ambiente.    
    7. Maxted WR. The use of bacitracin for identifying group A haemolitic streptococci. J. Clin. Pathol. 6, 224-226, 1953. 8. 4. Moellering RC Jr, Koreniowski OM, Sande MA, Wennersten CB. Species-specific resistance to antimicrobial synergism in Streptococcus faecium and Streptococcus faecalis. J. Infect. Dis. 140, 202-208, 1971.
    9. Pollock HM, Dahlgren BJ. Distribution of streptococcal groups in clinical specimens with evaluation of bacitracin screening. Appl. Microbiol. 27, 141-143, 1974.
  10. Schierl SA, Blazevic DJ. Rapid identification of enterococci by reduction of litmus milk. J. Clin. Microbiol. 14, 227228, 1981.
Inoltre, nei confronti del test di sensibilità alla Bacitracina, il "Peptidasi A Test" è sicuramente più specifico.  
  11. Thomsberry C, Baker CN, Facklam RR. Antibiotic susceptibility of Streptococcus bovis and other group D streptococci causing endocarditis. Antimicrob. Ag. Chemother. 5, 228-233, 1974.
Anche nell'identificazione presuntiva degli Enterococchi il "Peptidasi A Test" rappresenta una valida alternativa alle prove convenzionali per le sue riscontrate caratteristiche di sensibilità e specificità.    
    12. Watanakunakom C. Penicillin combined with gentamicin or streptomycin: synergism against enterococci. J. Infect. Dis. 124, 581-586, 1971.